免疫分析
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Western-bloting技术服务 酶联免疫反应 免疫组化技术服务
Western-bloting技术服务
一、Western-bloting技术原理
  免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。
二、Western-bloting技术流程

1.         蛋白质抽提 
a. 
实验对象为组织样品,取适量(250~500mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂),匀浆后抽提总蛋白(或核蛋白)。 
b. 
实验对象为细胞样品,每份样品取1×1061×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂)抽提总蛋白(或核蛋白)。

2.         蛋白质定量按蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。

3.         变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE) 将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样,标准加进第一个孔中,电泳分离蛋白。

4.         蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层,30mA恒流条件下,4°C转移过夜。

5.         膜的封闭和抗体孵育 
 a. 
膜在5BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。 
 b. 
封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时,抗原抗体结合。 
 c. 
加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6.         结果检测化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

7.         数据分析 目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH的灰度值以校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

8.         提供实验报告包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表。

三、WB样本准备  
  组织样品(新鲜或是正确保存的组织)250-500mg;细胞样本≥1×106个细胞数。此外客户需提供有效的一抗或代购。客户需提供检测目的蛋白的详细背景资料,以及样本的种属,类型。
 
酶联免疫反应
一、ELISA原理
  ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA竞争法。
二、ELISA实验操作    

1.         取出试剂盒,于室温(20-25)放置15-30分钟。实验过程应在室温(20-25)进行。

2.         取出酶标板,按照标准品的次序分别加入50 μl的标准品溶液于空白微孔中。

3.         空白微孔中加入50 μl的样品,空白对照加入100μl的蒸馏水。

4.         在各孔中加入100μl的酶标记溶液(不含空白对照孔)。

5.         将酶标板用封口胶密封后,37孵育反应 1小时(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)。

6.         充分清洗酶标板5次,保持各孔有充足的水压(浓缩洗涤液以1100的比例与蒸馏水稀释

7.         酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。

8.         各孔加入显色剂A 50 μl

9.         各孔加入显色剂B 50 μl

10.     20-25下避光反应15分钟。

11.     各孔加入50μl终止液,终止反应。

三、ELISA样本准备
  在收集标本前都必须有一个完整的计划,必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们提倡新鲜标本尽早检测,对收集后当天就进行检测的标本,及时储存在4℃备用,如有特殊原因需要周期收集标本,请造模取材后,将标本及时分装后放在-20℃或-80℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差,蛋白极易降解,直接影响实验质量,所以避免反复冻融。客户取材前须向我司销售人员索要说明书,具体操作注意事项请与我司技术人员沟通。
◇液体类标本:
  包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。
  *血清:
室温血液自然凝固1个小时后,离心10分钟左右(3000-5000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
  *血浆:
应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心10分钟左右(3000-5000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
        *尿液:
用无菌管收集。离心10分钟左右(3000-5000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
        *细胞培养上清:
检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心10分钟左右(3000-5000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心10分钟左右(3000-5000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
        *组织标本:
切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心10分钟左右(3000-5000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
 
免疫组化技术服务
一、免疫组化原理
  根据抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合,再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应,前者再用标记辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合,最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分,在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
二、免疫组化实验操作 

   1.         60烤片2小时

   2.         脱蜡。二甲苯脱蜡15分钟,三次

   3.         水化。依次经过无水乙醇、95%90%80%70%,各5分钟,蒸馏水(或自来水)5分钟

   4.         PBS5分钟,三次

   5.         抗原修复。枸橼酸缓冲液(约92-95)煮沸(沸水浴)修复15分钟,自然凉至室温。PBS5分钟,三次

   6.         3%双氧水封闭20分钟,PBS5分钟,三次

   7.         正常山羊血清封闭,3720分钟

   8.         一抗孵育,4过夜.

   9.         复温20分钟,PBS5分钟,三次

   10.     二抗孵育,3720分钟(二抗为生物素标记的羊抗兔IgG),PBS5分钟,三次

   11.     三抗孵育,3720分钟(三抗为辣根酶标记的链酶亲和素),PBS5分钟,三次

   12.     DAB显色,镜下观察结果,适时终止

   13.     苏木素复染5分钟,自来水冲洗片刻,75%的盐酸酒精溶液分化30秒,自来水冲洗5分钟蓝化

   14.     脱水。依次经过70%80%90%95%、无水乙醇,各5分钟,二甲苯15分钟,三次

   15.     封片,中性树胶封片

三、免疫组化样本准备
  组织切片或组织蜡块
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